6. Controles microbiológicos
6.c. Test de esterilidad del producto terminado
6.c.a.1 El personal conoce cómo obtener muestras representativas de los lotes elaborados
Para obtener una muestra representativa deben incluirse especialmente muestras tomadas de las partes del lote que se consideren con mayor riesgo de contaminación, por ejemplo:
- En el caso de productos que se hayan llenado asépticamente, las muestras deben obtenerse de las unidades llenadas al principio y al final del lote, y, después de cualquier intervención significativa (como el último vial antes de cambiar el filtro).
- En el caso de productos que se hayan sometido a esterilización por calor en su envase final, debe procurarse tomar muestras procedentes de la parte potencialmente más fría de la carga.
En el caso de Nutriciones parenterales la Farmacopea Francesa y Británica establecen, para soluciones de gran volumen, la toma de una muestra del 10% o un mínimo de 50ml, sin pérdida de la unidad examinada.
Según la GBPM, en el caso de preparaciones estériles compuestas por más de 25 unidades/lote se debe realizar un control de calidad fisicoquímico y microbiológico antes de la aprobación y liberación del producto terminado.
6.c.a.2 El personal conoce los procedimientos del centro para la realización de controles microbiológicos rutinarios de los productos que se preparan.
El ensayo de esterilidad se realiza en condiciones asépticas para evitar la contaminación de la muestra durante la prueba. Existen dos procedimientos distintos para la realización del test de esterilidad uno por inoculación directa de la muestra en un medio de cultivo y otro por filtración.
Los medios de cultivo utilizados son los mismos en los dos tipos de pruebas:
- Tioglicolato (FTG) para bacterias anaerobias y aerobias.
- Fluido Tripticasa Soja (TSB) para hongos y bacterias aerobias.
Estos medios de cultivo favorecen el crecimiento de microorganismos por lo que si la muestra que se siembra está contaminada podremos detectarlo.
Siembra directa en un medio de cultivo
Consiste en transferir directamente a los medios de cultivo, mediante técnica aséptica, la cantidad de preparación a examinar indicada en el procedimiento correspondiente. Una mala manipulación durante la siembra puede dar falsos positivos.
Cuando sea necesario examinar un volumen grande del producto, es preferible usar medios de cultivo concentrados, preparados de manera que se tenga en cuenta la dilución posterior. En ciertos casos el medio de cultivo concentrado puede añadirse directamente al producto a examinar en su envase.
En el caso de Nutriciones parenterales en las que tenemos que tomar una muestra de al menos 50 ml se debe procurar que el volumen del medio de cultivo sea unas 10 veces superior al de la muestra, para que la osmolaridad de ésta no afecte al crecimiento microbiano (por ejemplo, para 50 mL de muestra el volumen idóneo será 500 mL de medio).
Filtración a través de membrana
Este es el método recomendado por la Real Farmacopea Española aunque no es el más empleado a nivel de formulación magistral y preparados hospitalarios.
En este proceso se utiliza un aparato que permite mantener la asepsia de todo el proceso. Tanto el aparato de filtración, como la membrana, se esterilizan por los medios adecuados.
Mediante un sistema conectado a la muestra, esta se hace pasar a través de dos filtros incluidos dentro de otros dos envases estériles. Una vez filtrada la muestra se elimina todo el líquido sobrante, quedando retenida en el filtro las partículas con un tamaño mayor al del poro.
A continuación, cada uno de los frascos se llena con un medio de cultivo diferente: un frasco se llena con TSB y otro con FTG.
En nutrición parenteral el método de filtración recomendado consiste en tomar dos muestras de la NP, de 50 y 20 mL. La muestra de 50 mL es utilizada para el ensayo microbiológico y la de 20 mL es utilizada como control en el caso de crecimiento microbiano en la muestra de 50mL.
La muestra de 50 mL se mezcla con igual volumen de una solución estéril al 4% de polisorbato 80 (Tween 80) en agua para inyección. La mezcla se agita y se filtra con ayuda de vació a través de un filtro de membrana de nitrato de celulosa de 0,45 µm. Después de la filtración, el filtro se lleva a un medio agar-sangre y se incuba en una atmósfera enriquecida con 5-7% de CO2 durante 48 horas, y posteriormente se lleva a 20ºC en una atmósfera aeróbica durante 5 días.
Una vez sembrados los medios de cultivo, independientemente del método utilizado, se deben incubar 14 días a las temperaturas recomendadas TSB 20- 25ºC y FTG 30-35ºC. Se incubarán los medios sembrados y otros dos medios sin sembrar como blancos.
Al final del periodo de incubación la contaminación se manifiesta por la aparición de turbidez, motas o floculación en el medio, mientras el medio sin inocular permanece trasparente y sin turbidez Si el material analizado causa turbidez del medio, se deben realizar subcultivos en medios sólidos apropiados después de la incubación para decidir si la turbidez se debe al material solamente o a los microorganismos que se han multiplicado en el caldo.
Si se confirma la contaminación se debe considerar todo el lote contaminado salvo que se pueda probar que se ha contaminado durante el test de esterilidad
En caso de preparación por lotes, mientras se realiza el control de esterilidad, la muestra se queda en cuarentena hasta que se obtengan los resultados y se pueda liberar el lote.